趙夢路
分離的人類胰島的三維重建:綠色的胰島素(AF488)，紅色的胰高血糖素(AF555)，洋紅色的IL-17 (AF647)和藍色的細胞核（Hoechst）Courtesy Prof. Von Herrath, San Diego, CA (USA)
細胞是生命的基本單位，細胞生物學是研究細胞結構和功能的學科。細胞生物學研究熱點主要聚焦在細胞內(nèi)部結構、細胞信號通路、細胞器功能和結構解析、能量代謝和表觀遺傳等方面，細胞生物學研究難點在于細胞是非常精密且微小的單位，而觀察設備存在空間、時間以及分辨率上的限制。
隨著顯微鏡和染色技術的改進，科學家們能夠看到越來越多的細胞內(nèi)部細節(jié)。范·列文虎克使用的顯微鏡可能把標本放大了幾百倍。今天，高分辨率熒光顯微鏡可以在微米及以下范圍觀察細胞器的形狀，借助活細胞工作站可以將細胞的生命活動完整記錄下來；通過激光掃描共聚焦顯微鏡，可以對細胞進行三維光學切片成像，使研究人員能夠生成細胞的詳細三維圖像；利用STED納米顯微鏡可以探究細胞器內(nèi)部結構、離子通道的亞基甚至分子水平的精細結構信息……想要充分擴展自己的研究成果并獲得高質量的數(shù)據(jù)，選擇合適的顯微成像方法至關重要。
細胞生物學研究痛點
細胞精細結構解析解決
STED是基于STELLARIS共聚焦平臺純光學超高分辨技術，結合快速熒光壽命采集系統(tǒng)實現(xiàn)XY軸30nm分辨率極限。同時運用FLIM Phasor技術可顯著降低STED激光能量，適用于活細胞超高成像。TauSTED特別適合應用于組織和細胞內(nèi)微小結構和物質的觀察，如膜蛋白與膜微結構域、細胞器內(nèi)部的微小結構觀察、細胞骨架結構、神經(jīng)元突觸研究、細菌內(nèi)部的物質結構研究、病毒學研究、蛋白復合物研究等等。
借助STED技術揭示核孔復合物結構
STED揭示不同狀態(tài)下線粒體膜融合過程
TIRF（全內(nèi)反射熒光顯微鏡）主要應用方向：細胞膜成像、囊泡運輸、單分子示蹤、受體動力學變化/聚集、受體超分辨成像、體外蛋白研究、細胞骨架組裝、胞吞胞吐、細胞粘附、細胞運動。
Hela細胞，使用Dil標記細胞膜（左圖普通熒光顯微鏡，右圖TIRF膜成像）
STELLARIS FALCON是Leica最新的集成整合方案，將FLIM結合到STELLARIS共聚焦平臺，實現(xiàn)快速FLIM數(shù)據(jù)采集。
目前，F(xiàn)LIM技術越來越多的應用到生物學研究中，常見的應用有測定分子相互作用FLIM-FRET，環(huán)境感知和組分分離等，在活細胞中典型應用就是利用FLIM-FRET研究活細胞分子相互作用。
排除熒光漂白和淬滅對FRET測定的影響，精準測量分子間相互作用強度。無需考慮acceptor熒光，實驗簡單?？蛇M行離體活細胞和在體活細胞快速FLIM-FRET測量。
FLIM研究活細胞代謝
Fast FLIM image and FLIM phasor plot of U2OS cells labeled with Flipper TR, left cell in cell culture medium, right cell treated with 5% concentration glucose
活細胞解決快速成像
細胞是組成生命個體的基本單位，實時在線研究細胞的增殖、代謝、凋亡和應激反應，有助于了解細胞的生命規(guī)律，通過現(xiàn)象揭示生命本質。
THUNDER高分辨活細胞解決方案
C2C12細胞生長和遷移到雙方transwell膜沾核纖層蛋白B(紅色)核結構,赫斯特(藍色)的DNA,和γH2AX DNA損傷(黃色)。細胞成像使用THUNDER活細胞培養(yǎng)成像系統(tǒng)與63X/1.4油浸物鏡。圖片上面代表擴展景深預測厚17.47µm z-stacks。圖片由美國加州大學戴維斯分校生物科學學院神經(jīng)生物學、生理學和行為系盧卡斯·史密斯博士提供。
STELLARIS Lightning
細胞生物學研究已經(jīng)不再局限于細胞層面觀察，而是聚焦于亞細胞器、染色體、離子通道等細小結構，傳統(tǒng)寬場熒光顯微鏡雖然有成像速度快、光毒性低的有點，但是空間分辨率并不能滿足對亞細胞器更精細結構解析的分辨率需求。Leica STELLARIS Lightning超分辨系統(tǒng)基于共聚焦平臺，XY分辨率達到120nm，Z方向達到了200nm，超越了普通共聚焦光學極限。
Gatta Cell，細胞核-DAPI，線粒體-Tom20 Alexa488，Actin-Alexa555，Tubulin-Alexa635
Lightning超分辨成像
STELLARIS的每個檢測器都是光譜式檢測器，可以實現(xiàn)410nm-850nm光譜檢測，配備485-685nm或440-790nm白激光，譜線任意可調(diào)，滿足染料最佳激發(fā)譜線需求。白激光和HyD檢測器實現(xiàn)激發(fā)和發(fā)射光譜檢測自由。STELLARIS共聚焦平臺使用棱鏡分光和狹縫檢測，在任意波長都可以有非常高的分光效率，利用熒光信號。
STELLARIS多色成像
NE-115 cells. LifeAct-mNeonGreen (left: yellow, right: red), MitoTracker Green (left: yellow, right: green), NUC Red (left: gray, right: blue), and SiR-tubulin (left: gray, right: magenta)?.Courtesy: Max Heydasch, University of Bern and Spirochrome
TauSense時間分辨共聚焦成像系統(tǒng)
NE-115細胞同時標記了actin-mNeonGreen、Mitotracker Green、細胞核Red和SiR-tubulin共4種熒光染料，但由于LifeAct-mNeonGreen和Mitotracker Green的發(fā)射光譜高度重疊，NuC Red和SiR-tubulin的發(fā)射光譜高度重疊，所以在用常規(guī)共聚焦（左圖）拍攝時只能體現(xiàn)出兩種信號的差異。而在TauSeparation模式下（右圖），基于平均光子到達時間AAT，我們使用一個檢測器就可以同時將這兩種發(fā)射光譜重疊的染料區(qū)分出來（LifeAct-mNeonGreen-紅色，Mitotracker Green-綠色，Nuc Red–青色，SiR-tubulin–品紅色），所以只需要使用兩個檢測器，就可以得到這幅沒有串色的4色熒光圖像了。
活體動物、類器官水平
STELLARIS DIVE光譜式多光子顯微成像系統(tǒng)
4Tune – the world’s first and only spectral NDD
Blue: Astrocytes, Sulforhodamine;Green: Microglia, GFP;Yellow: Neurons, YFP;Red: Blood, Alexa680-Dextran 活體小鼠在體腦細胞多色成像
多光子FLIM在活體細胞水平研究藥物靶向作用機理
用FLIM-FRET研究藥物對胰腺導管腺癌(PDAC)的靶向作用，實現(xiàn)了對腫瘤不同微區(qū)的單細胞反應的觀察。
Conway JRW, et al. Cell Rep. 2018 Jun 12;23(11):3312-3326.
Intravital Imaging to Monitor Therapeutic Response in Moving Hypoxic Regions Resistant to PI3K Pathway Targeting in Pancreatic Cancer
STELLARIS DLS光片成像
Leica STELLARIS共聚焦平臺可以無縫升級light sheet功能，升級后一套儀器同時擁有完整的共聚焦和光片的功能。Leica DLS數(shù)字光片技術可快速實現(xiàn)雙側照明，具有光毒性低，成像速度快，適合3D成像的優(yōu)點。DLS和雙光子共聚焦搭配，可以實現(xiàn)定點損傷和快速光片成像相結合。
Movie courtesy of B. Eismann/C. Conrad at BioQuant/DKFZ Heidelberg 3D培養(yǎng)細胞光片成像
細胞操作
- Leica DMi8 Infinity Scanner
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Hela Cells expression paGFP-H2B (histone marker). Courtesy Rebecca Smith, LMU, Munich.
Leica Infinity Scanner實現(xiàn)快速：
- 激光切割、消融、解籠鎖、DNA損傷
- 光激活、光開關、漂白、光遺傳
- FRET受體漂白法等光學刺激實驗
Leica DMi8 Infinity PLU脈沖激光模塊
Infinity PLU應用：
MDCK cells, cutting;Sample Courtesy: Prof. Dr. Ralf Jacob, Marburg, Germany
激光顯微切割精準取材
Leica激光顯微切割優(yōu)勢
- 正置鏡平臺，適合病理切片和活細胞樣本切割；
- 明場和熒光實時切割，操作簡單快速；
- 紫外激光切割，直接汽化，切緣平整不損傷生物大分子；
- 激光束移動切割，切割精度可達0.07μm；
- 重力收集，簡單高效，收集耗材成本低，實用高通量切割工具
單細胞克隆制備
THUNDER Imager EM Cryo CLEM冷凍光電聯(lián)用助力細胞超精細結構解析
傳統(tǒng)光電聯(lián)用受限于光鏡分辨率，熒光數(shù)據(jù)在電鏡下目標不明確，THUNDER Cryo-CLEM是冷凍光電聯(lián)用專用設備，具有分辨率高可以精準識別細胞結構，在相關工作流程中平穩(wěn)、安全傳送坐標、圖像和樣本。
冷凍光電聯(lián)用實驗流程Cryo-CLEM / Cryo-ET
徠卡冷凍光電聯(lián)用優(yōu)勢：
- 冷凍光鏡專用傳輸桿，更換樣品方便
- 傳輸桿液氮控溫，確保樣品安全轉移
- 有普通載網(wǎng)夾具和Auto grid夾具
- 該流程中所有附件均由徠卡提供，避免第三方紛爭
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