生理學(xué)條件下的顯微鏡成像
很多生物樣品都會(huì)產(chǎn)生自發(fā)熒光。它的光譜往往很寬，會(huì)干擾熒光標(biāo)記。本應(yīng)用指南論述了自發(fā)熒光如何作為熒光壽命成像顯微鏡(FLIM)中的內(nèi)在對(duì)比度，從而產(chǎn)生多色圖像。此外還概述了如何將光譜成像與熒光壽命信息相結(jié)合，以區(qū)分進(jìn)而識(shí)別生物樣品中的不同熒光組分。

 
顯微鏡遇見自發(fā)熒光
在熒光顯微鏡觀察中，自發(fā)熒光通常被視為很多生物樣品固有的瑕疵。它往往與內(nèi)源性熒光信號(hào)的光譜相重疊，且有時(shí)會(huì)掩蓋其信號(hào)。它可能會(huì)導(dǎo)致光譜拆分和熒光強(qiáng)度比率分析定量的困難。自發(fā)熒光通常具有極寬的發(fā)射光譜，這使它在普通的光譜成像中拆分起來(lái)非常困難。
但自發(fā)熒光本身也有其優(yōu)點(diǎn)。它是一種內(nèi)在的熒光信號(hào)，*自然無(wú)需標(biāo)記。本應(yīng)用指南旨在通過熒光壽命成像(FLIM)識(shí)別幾種自發(fā)熒光成分，并闡述它們?cè)谏镝t(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用
注：有關(guān)FLIM技術(shù)的基本原理，請(qǐng)參閱應(yīng)用指南《FRET with Flim - Quantitative in-vivo Biochemistry》
 
自發(fā)熒光遇見生命科學(xué)
大多數(shù)生物樣品含有可引起自發(fā)熒光的生化成分。例如，細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)反映在其NAD(P)H和flavins的濃度上。前者更適合用IR光源激發(fā)，后者也可以用405 nm激發(fā)。很多結(jié)構(gòu)蛋白（例如膠原蛋白、彈性蛋白和纖原蛋白）都可以得到其熒光壽命圖像。
植物細(xì)胞尤其富含大量自發(fā)熒光分子。極為常見的有葉綠素、類胡蘿卜素、多酚等。通常情況下，這些化合物不僅可以提供無(wú)標(biāo)記自發(fā)熒光，還可以提供有關(guān)細(xì)胞或組織中代謝狀態(tài)或病理狀態(tài)的信息。因此，可以通過FLIM和自發(fā)熒光結(jié)合得出有關(guān)細(xì)胞功能的結(jié)論。
 
無(wú)標(biāo)記反差
為了說(shuō)明自發(fā)熒光在生物樣品中的作用，我們將分別考察動(dòng)物界和植物界的示例。
我們先來(lái)看介殼蟲。收集并立即制作這種寄生蟲不同發(fā)育階段的標(biāo)本。使用10倍物鏡記錄激發(fā)波長(zhǎng)為470 nm處自發(fā)熒光的概覽圖像（圖1）。熒光強(qiáng)度圖像FLIM數(shù)據(jù)創(chuàng)建，充分呈現(xiàn)了樣品的結(jié)構(gòu)。此處的強(qiáng)度是每個(gè)像素的光子計(jì)數(shù)，而非標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)度圖像。熒光強(qiáng)度無(wú)法區(qū)分任何自發(fā)熒光種類（圖1A）。這些信息包含熒光壽命圖（圖1B），呈現(xiàn)空間熒光壽命分布，它提供了不同熒光壽命成分的圖像。
就自發(fā)熒光而言，這通常代表不同的分子種類或其組合。我們可以很好地區(qū)分觸角和腿周圍殼多糖化的外骨骼（綠色到藍(lán)色）。殼多糖的壽命很短。周圍組織的熒光壽命比較均一接近3 ns（黃色）。某些具有較長(zhǎng)壽命（橙色）的區(qū)域可能代表其他物質(zhì)，但在此處，它們更可能代表較暗的區(qū)域，這些區(qū)域在熒光壽命的測(cè)量精度較低。
通常作為FLIM圖像感知和傳達(dá)的內(nèi)容實(shí)際上是強(qiáng)度調(diào)制熒光壽命圖（圖1C）。熒光壽命信息乘以強(qiáng)度圖像。這種再現(xiàn)方式傾向于不強(qiáng)調(diào)光子較少統(tǒng)計(jì)較差的較暗區(qū)域，并且保留了強(qiáng)度圖像中包含的更多結(jié)構(gòu)信息。后者通常有助于解釋熒光壽命，例如熒光壽命圖中的橙色區(qū)域。我們可以得出結(jié)論，F(xiàn)LIM能讓我們?cè)诓皇芨蓴_的情況下識(shí)別不同的分子種類并研究其空間相互關(guān)系。

 
圖1：介殼蟲的自發(fā)熒光圖像（腹面觀）。強(qiáng)度圖像(A)、熒光壽命圖(B，去背景) 和強(qiáng)度調(diào)制熒光壽命圖像(C)。熒光壽命圖顯示至少三個(gè)不同顏色編碼不同熒光壽命，并顯示空間位置信息。長(zhǎng)度為1.5 mm，截面厚度為1.3 μm。掃描格式280 x 512，物鏡10x NA 0.4，用470 nm激發(fā)，檢測(cè)478 nm至703 nm的發(fā)射（樣品由荷蘭阿姆斯特丹NCI的Kees Jalink提供）。
深度–三維熒光壽命成像
仔細(xì)觀察自發(fā)熒光圖像（圖1），我們會(huì)發(fā)現(xiàn)觸角外部有藍(lán)色區(qū)域，內(nèi)部有綠色區(qū)域。那么，綠色區(qū)域是代表不同的成分，還是殼多糖熒光（藍(lán)色編碼）和周圍組織（黃色編碼）的混合？為了解決這個(gè)問題，我們可以在較小的區(qū)域上使用較高NA的物鏡。我們還必須考慮圖像的z擴(kuò)展。為了更好地觀察結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，我們可以記錄FLIM z-stack（圖2）。事實(shí)證明，較短的壽命是由殼多糖引起，因?yàn)橛|角內(nèi)部的熒光壽命與中間切面顯示的周圍組織熒光壽命相同（圖2A，白框）。可以使用z-stack最大投影查看厚的結(jié)構(gòu)（圖2B）。等值面渲染促進(jìn)了對(duì)3D切面結(jié)構(gòu)的更充分了解（圖3）。請(qǐng)注意，關(guān)節(jié)不含殼多糖，這在FLIM數(shù)據(jù)中清晰可見。FLIM圖像能看到重要的分類特征，例如散布在所有身體部位的毛狀剛毛，它們顯然含有殼多糖成分。

 
圖2：介殼蟲觸角的FLIM z-stack。使用40x NA 1.25鏡頭(A)記錄了約1 μm深度的40個(gè)切面。最大投影顯示了觸角和一些殼多糖化的毛發(fā)(B)。最大投影使用第三方軟件完成。視場(chǎng)為388 x 151 μm。
 

圖3：使用圖2中顯示的層切圖像形成觸角的3D圖像。殼多糖化結(jié)構(gòu)出現(xiàn)在帶有陰影的等值面渲染中（綠色）與周圍組織的3D圖像重疊顯示。（3D可視化使用外部軟件完成）。
多色自發(fā)熒光
植物中的熒光成像通常會(huì)受到多種熒光物質(zhì)的影響，例如葉綠素和多種細(xì)胞壁成分以及多種內(nèi)源性色素。在這里，我們利用這些內(nèi)在的自發(fā)熒光團(tuán)來(lái)顯示難以區(qū)分的結(jié)構(gòu)。我們記錄了從百合花中提取的花粉粒（小孢子）的z-stack熒光壽命圖像（圖4）。花粉粒的花藥具有肉眼可見和透射光（未顯示）可見的橙黃色。植物界中此類黃色熒光物質(zhì)的可能的物質(zhì)是類胡蘿卜素。我們獲得了0.5 ns到1.2 ns的熒光壽命。兩個(gè)主要物質(zhì)的熒光壽命形成鮮明對(duì)比。綠色的是（假定的）管單元的網(wǎng)狀外層，它圍繞著呈現(xiàn)為藍(lán)色(0.5 ns)的核心。Z切片顯示該核心未填充壽命較短的物質(zhì)，而是在管細(xì)胞周圍形成薄的內(nèi)層（圖4A）。最大投影圖（圖4B）和3D可視化圖（圖4C）有助于清晰顯示兩個(gè)層的相對(duì)立體結(jié)構(gòu)。

 
圖4：百合（百合花）的小孢子（花粉粒）。使用470 nm激發(fā)的自發(fā)熒光揭示了管細(xì)胞外層中兩種結(jié)構(gòu)不同的熒光物質(zhì)。使用20x NA 0.7鏡頭檢測(cè)從482 nm到744 nm(A)的發(fā)射熒光，記錄了45個(gè)Z軸層面（A）。使用外部軟件(B)進(jìn)行最大投影，并使用外部軟件(C)進(jìn)行3D等值面渲染。孢子的縱向延伸為130 μm。

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