如何利用激光顯微切割技術(shù)（LMD）對(duì)爪蟾蝌蚪的視神經(jīng)進(jìn)行精確一致的橫切        

由于哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的自我修復(fù)能力有限以及傳統(tǒng)損傷模型的不一致性，視神經(jīng)再生是神經(jīng)生物學(xué)的一大挑戰(zhàn)。相比之下，爪蟾蝌蚪的視神經(jīng)在受傷后可以再生，因此是研究軸突再生的分子和細(xì)胞機(jī)制的理想模型。在本應(yīng)用說(shuō)明中，我們展示了如何利用激光顯微切割技術(shù)（LMD）對(duì)蝌蚪的視神經(jīng)進(jìn)行精確、一致的橫切，從而開(kāi)發(fā)出適合成像、轉(zhuǎn)錄組分析和功能恢復(fù)研究的高重復(fù)性損傷模型。

簡(jiǎn)介       

視神經(jīng)是視網(wǎng)膜和大腦之間的聯(lián)系紐帶，由視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGC）軸突組成。這些軸突的跨度相對(duì)較大，其功能是維持視覺(jué)過(guò)程。在人類(lèi)等哺乳動(dòng)物中，視神經(jīng)在受傷后的自我修復(fù)能力非常有限，往往會(huì)導(dǎo)致視力完全喪失。要改善這些患者的治療效果，我們首先需要充分了解自然界中的物種神經(jīng)再生的機(jī)制。在青蛙身上，視神經(jīng)受損后會(huì)自發(fā)地完全再生并恢復(fù)視力。這為我們提供了一個(gè)理想的模型系統(tǒng)，以了解成功的視神經(jīng)再生所涉及的基本機(jī)制，并為最終在再生能力不足的物種中使用視力保護(hù)療法確定目標(biāo)途徑。

視神經(jīng)人工損傷模型面臨的挑戰(zhàn)     

使用解剖顯微鏡手動(dòng)操作蝌蚪視神經(jīng)需要高超的顯微外科技術(shù)，而且動(dòng)物體型小且易碎，這對(duì)手術(shù)操作提出了挑戰(zhàn)。即使使用微型機(jī)械手和精細(xì)鑷子，人工橫切也是一種侵入性操作，很難在不同操作者之間實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，而且往往會(huì)導(dǎo)致很高的死亡率。病灶大小和位置可能會(huì)有很大差異，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)重復(fù)的不一致性。這些技術(shù)限制影響了模型的可重復(fù)性，降低了下游分析的統(tǒng)計(jì)能力。因此，特別是在需要精確控制視神經(jīng)損傷的空間或時(shí)間的研究中，很難得出可靠的結(jié)論。    

治療視神經(jīng)損傷的新型激光顯微切割法     

為了開(kāi)發(fā)一種新的手術(shù)模型，LMD7與Xla.Tg（tubb2b：mapt-GFP）Amaya轉(zhuǎn)基因X. laevis品系一起用于可視化和進(jìn)行視神經(jīng)橫斷及隨后的軸突再生。蝌蚪的發(fā)育階段為43-46期。在這些階段，蝌蚪是透明的，可用于實(shí)時(shí)熒光成像。簡(jiǎn)言之，蝌蚪被麻醉后，被放置在由4%瓊脂糖制成的特制手術(shù)床上，手術(shù)床位于腔室載玻片內(nèi)。蝌蚪的朝向是背朝上平放。使用Leica LMD7軟件中的“測(cè)量”工具，在放大5倍的情況下，用349 nm紫外激光切割器在視神經(jīng)從球狀體出口的遠(yuǎn)端約300 μm處橫切每只蝌蚪的左側(cè)視神經(jīng)。用“繪制”工具在視神經(jīng)上繪制的線(xiàn)接受四次激光脈沖（120 µJ/脈沖），激光功率為55 mW（脈沖頻率 = 2710），采用激光螺旋模式（步數(shù) = 2，步長(zhǎng) = 5 μm，重復(fù)次數(shù) = 2），以切割到適當(dāng)深度并橫切神經(jīng)。熒光視神經(jīng)顯像中的缺口確認(rèn)了切割。然后立即取出蝌蚪，在1X MMR培養(yǎng)基中復(fù)原，并用于隨后的下游實(shí)驗(yàn)。

圖 1：新型激光模型可實(shí)現(xiàn)精確且可重復(fù)的視神經(jīng)切斷。

A) 使用Xla.Tg (tubb2b: mapt-GFP) Amaya轉(zhuǎn)基因X. laevis品系的LMD7實(shí)驗(yàn)裝置。

B) 蝌蚪在麻醉后被放置在腔室載玻片內(nèi)由4%瓊脂糖制成的小型手術(shù)臺(tái)上，使其背側(cè)朝上并保持平坦。

C) GFP通道中術(shù)前和術(shù)后內(nèi)源性標(biāo)記的視神經(jīng)圖像。術(shù)后圖像中熒光間隙表明視神經(jīng)已成功切斷。

D) 三只蝌蚪的代表性圖像，顯示該模型在精確性和可重復(fù)性方面的表現(xiàn)，其視神經(jīng)均在距離眼睛相同的位置被切斷。

結(jié)果     

這種激光顯微切割方法可實(shí)現(xiàn)高通量、可重復(fù)和微創(chuàng)的視神經(jīng)橫切，從而在損傷后短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)強(qiáng)大的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGC）軸突再生。利用LMD7的精確性，可確保不同生物復(fù)制中病變位置的一致性，這對(duì)下游分析至關(guān)重要。該模型已被應(yīng)用于通過(guò)縱向共焦成像研究軸突動(dòng)態(tài)、繪制結(jié)構(gòu)變性和再生（約14天）的時(shí)間表、研究細(xì)胞死亡和增殖、評(píng)估視覺(jué)通路恢復(fù)，以及通過(guò)RNA-seq描述早期轉(zhuǎn)錄組反應(yīng)的特征。此外，該方案還與其他轉(zhuǎn)基因蝌蚪品系兼容，如表達(dá)基因編碼傳感器的蝌蚪品系。例如，Xla.Tg (tubb2b:GCaMP6s)NXR 株系被用來(lái)觀察激光損傷開(kāi)始時(shí)視神經(jīng)中的鈣動(dòng)態(tài)。 

視頻1：切片三天后，觀察到左側(cè)視神經(jīng)損傷部位出現(xiàn)軸突萌芽，而對(duì)側(cè)神經(jīng)保持完好。通過(guò)徠卡共聚焦顯微鏡從麻醉的爪蟾蝌蚪身上獲取Z疊圖像，從而實(shí)現(xiàn)了再生動(dòng)態(tài)的原位可視化。

視頻2：通過(guò)Xla.Tg (tubb2b:GCaMP6s)NXR株觀察鈣動(dòng)態(tài)。在激光橫切期間和之后連續(xù)進(jìn)行成像。激光損傷會(huì)導(dǎo)致鈣離子迅速進(jìn)入神經(jīng)。視頻被加速，熒光強(qiáng)度顯示為熱圖。   

結(jié)論     

這種基于LMD激光的方法提供了所需的精確度，可產(chǎn)生一致的病變，同時(shí)將脫靶損傷降至最低，克服了人工技術(shù)的局限性。因此，它為研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生機(jī)制提供了一個(gè)功能強(qiáng)大且可重復(fù)的平臺(tái)。該模型可用于未來(lái)的定向基因操作實(shí)驗(yàn)，從而擴(kuò)展再生神經(jīng)科學(xué)研究的工具包。

參考文獻(xiàn)： 

1. Moulin, C.、Dvoriantchikova, G.、Bineshfar, N. 等人. 新型視神經(jīng)橫斷激光模型為視神經(jīng)再生動(dòng)力學(xué)提供了寶貴的見(jiàn)解?？茖W(xué)報(bào)告 14，27412（2024 年）

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