熒光劑與熒光顯微鏡配合使用，可觀察標(biāo)本中的特定細(xì)胞成分。試劑可以是熒光染料（如 ATTO Rho6G（羅丹明））、熒光蛋白（如 GFP（綠色））或免疫熒光染色劑（如 ATTO 488-抗體共軛物）。熒光蛋白在相關(guān)細(xì)胞蛋白中表達(dá)與遺傳相關(guān)。它們通常用于研究活細(xì)胞。在某些情況下，熒光蛋白會導(dǎo)致有關(guān)細(xì)胞蛋白的功能障礙或誤解。如果蛋白質(zhì)克隆不可能或不切實(shí)際，例如涉及組織學(xué)標(biāo)本，則可使用免疫熒光染色等技術(shù)來觀察感興趣的細(xì)胞蛋白質(zhì)。為此，抗體與不同的熒光染料相連，以便直接或間接地與目標(biāo)結(jié)構(gòu)結(jié)合。甚至還有針對特定應(yīng)用的活細(xì)胞染料品種，可以觀察細(xì)胞器，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）、線粒體和高爾基體。還有一些功能測試可對活細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，以跟蹤細(xì)胞增殖和凋亡等過程，以及區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞（活/死檢測）。即使是非生物物質(zhì)，如細(xì)胞中的鈣（Ca）離子，也可以用熒光鈣指示劑來檢測。

主要經(jīng)驗(yàn)

1、熒光顯微鏡可使用多種染料來研究生物標(biāo)本并觀察特定的細(xì)胞成分。

2、科學(xué)家可以利用點(diǎn)擊化學(xué)的優(yōu)勢，使用非天然氨基酸與抗體和納米抗體對生物大分子進(jìn)行正交熒光標(biāo)記。

3、有許多熒光染料可供使用。例如：與熒光標(biāo)記抗體結(jié)合的染料、FITC 和 TRITC、ATTO 染料、DNA/RNA 染色劑（如 DAPI 和 Hoechst 染料）、用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染色的 DiOC6(3)、用于離子成像的 fura-2、fluor-3、鈣綠、SBFI 和 PDFI，以及用于功能檢測的 ATTO 染色試劑盒。

4、如列表所示，每種染料在激發(fā)光譜和發(fā)射光譜中都有一個明顯的峰值。當(dāng)同時使用幾種染料時，如用于多重分析和空間生物學(xué)，必須了解激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的重疊會導(dǎo)致錯誤的陰性或陽性結(jié)果，或使數(shù)據(jù)模糊不清。

本文將介紹常用的熒光染料并概述其特性。熒光顯微鏡借助熒光染料、熒光蛋白或使用抗體的免疫熒光染色來研究特定的細(xì)胞成分。由于熒光劑種類繁多，熒光顯微鏡可用于檢查蛋白質(zhì)、核酸、聚糖、細(xì)胞器和其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

熒光染料和顯微鏡

熒光劑與熒光顯微鏡配合使用，可觀察標(biāo)本中的特定細(xì)胞成分。試劑可以是熒光染料（如 ATTO Rho6G（羅丹明））、熒光蛋白（如 GFP（綠色））或免疫熒光染色劑（如 ATTO 488-抗體共軛物）。熒光蛋白通過基因連接，在相關(guān)細(xì)胞蛋白中表達(dá)[1]。它們通常用于研究活細(xì)胞。在某些情況下，熒光蛋白會導(dǎo)致有關(guān)細(xì)胞蛋白的功能障礙或誤解。如果蛋白質(zhì)克隆不可能或不切實(shí)際，例如涉及組織學(xué)標(biāo)本，則可使用免疫熒光染色等技術(shù)來觀察感興趣的細(xì)胞蛋白質(zhì)。為此，抗體與不同的熒光染料相連，以便直接或間接地與目標(biāo)結(jié)構(gòu)結(jié)合。甚至還有針對特定應(yīng)用的活細(xì)胞染料品種，可以觀察細(xì)胞器，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）、線粒體和高爾基體。還有一些功能測試可對活細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，以跟蹤細(xì)胞增殖和凋亡等過程，以及區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞（活/死檢測）。即使是非生物物質(zhì)，如細(xì)胞中的鈣（Ca）離子，也可以用熒光鈣指示劑來檢測。下文概述了常用的熒光染料。

利用點(diǎn)擊化學(xué)進(jìn)行熒光標(biāo)記

一般來說，"點(diǎn)擊化學(xué) "利用的是無有害副產(chǎn)物、化學(xué)收率高和產(chǎn)物穩(wěn)定的化學(xué)反應(yīng) [2]。科學(xué)家可以利用點(diǎn)擊化學(xué)來開發(fā)化學(xué)反應(yīng)，通過將小單元連接在一起，快速可靠地生成物質(zhì)。這使他們能夠使用非天然氨基酸 (UAA) 對生物大分子與抗體和納米抗體進(jìn)行正交熒光標(biāo)記。ATTO-TEC 和其他公司生產(chǎn)的疊氮和炔烴官能化染料可用于點(diǎn)擊化學(xué)應(yīng)用 [3]。點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)的例子包括銅催化的 Huisgen 疊氮烷烴環(huán)化反應(yīng)，在染料和目標(biāo)分子之間形成三唑連接；以及作為點(diǎn)擊試劑的 DBCO 衍生物染料，用于無催化、應(yīng)變促進(jìn)的疊氮烷烴環(huán)化反應(yīng) [3]。

免疫熒光染料

通過熒光標(biāo)記抗體與細(xì)胞中特定的相關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)合，就可以用熒光顯微鏡對這些蛋白質(zhì)進(jìn)行研究。就組織學(xué)標(biāo)本而言，無法使用熒光蛋白，因?yàn)闃?biāo)本一般來自不表達(dá)任何熒光蛋白的生物體。此外，如果有有效的抗體，使用免疫熒光技術(shù)比熒光蛋白技術(shù)要快得多。

免疫熒光利用了抗體與抗原的特異性結(jié)合親和力。它采用了兩種不同的方法。直接免疫熒光是簡單的方法，它將熒光標(biāo)記的抗體直接與感興趣的蛋白質(zhì)結(jié)合。不過，在大多數(shù)情況下使用的是間接免疫熒光。它需要兩種抗體，其中第一種（第一抗體）與目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合，但本身不帶熒光標(biāo)記。第二種抗體（第二抗體）與第一抗體結(jié)合，專門攜帶熒光染料。間接免疫熒光有幾個優(yōu)點(diǎn)。一方面會產(chǎn)生放大效應(yīng)，因?yàn)橥恢挂环N二抗與一抗結(jié)合。另一方面，用相關(guān)熒光染料標(biāo)記的二抗通常比一抗更容易找到。

FITC和TRITC

異硫氰酸熒光素(FITC)是一種有機(jī)熒光染料，目前仍常用于免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)中。它的激發(fā)峰和發(fā)射峰分別為 495 納米和 517 納米，可借助其活性異硫氰酸酯基團(tuán)與蛋白質(zhì)的氨基、巰基、咪唑?；?、酪氨?；螋驶Y(jié)合，從而與不同的抗體偶聯(lián)。FITC 是用于熒光顯微鏡的染料之一，也是 ATTO 488、Alexa 488 等其他熒光染料的前身。它的熒光活性源于其自身的大共軛芳香電子結(jié)構(gòu)，在藍(lán)色光譜中會被光所激發(fā)。用 ATTO 488 染色的標(biāo)本示例見圖 1。

圖 1：甲醇固定的 MDA-MB-468 細(xì)胞圖像，其中 EGF 受體用 AZ-271 標(biāo)記的 affibody（紅色）染色，Ki67 用抗 Ki67 的兔 IgG（一級）染色，ATTO-647N 標(biāo)記的抗兔的驢 IgG-fab2-片段（二級，藍(lán)色）染色，管蛋白抗體用抗 beta 管蛋白的鼠 IgG（一級）染色，ATTO 488 標(biāo)記的抗鼠的驢 IgG-fab2-片段（二級，綠色）染色、藍(lán)色）、小鼠 IgG 抗 beta 管蛋白抗體染色（一級）和 ATTO 488 標(biāo)記的驢 IgG-fab2-片段抗小鼠抗體染色（二級，綠色）。

經(jīng)常與FITC配合使用的一種染料是同出一門的TRITC（四甲基羅丹明-5-（和6）-異硫氰酸酯）。與 FITC 不同，TRITC 不是熒光素，而是羅丹明家族的衍生物。羅丹明還具有大型共軛芳香電子系統(tǒng)，這使其具有熒光特性。TRITC被波長為550納米的綠色光譜光激發(fā)。其發(fā)射波長為 573 納米?？贵w與蛋白質(zhì)的結(jié)合是以活性異硫氰酸酯基團(tuán)為基礎(chǔ)的。

盡管 FITC 和 TRITC 仍被廣泛使用，但由于它們的光穩(wěn)定性低、水溶性差，屬于弱熒光染料，因此不建議用于顯微鏡檢查。

其他類型的染料

ATTO 染料或標(biāo)簽包括許多親水性熒光染料、熒光淬滅劑以及大斯托克斯偏移和氧化還原染料，它們都用于熒光顯微鏡。有些 ATTO 染料基于基本熒光物質(zhì)，如羅丹明、羰基羅丹明、噁嗪或吖啶。例如 ATTO 386H、ATTO 465、ATTO 532、ATTO 647N 和 ATTO 680。例如，ATTO 488 的激發(fā)波長為 500 納米，發(fā)射波長為 520 納米。它的特性與 FITC 相似，但穩(wěn)定性更好，亮度更高，pH 值敏感性更低。用不同 ATTO 染料染色的樣本示例見圖 2 和圖 3。

圖 2：相分離的巨-單拉美柱狀泡（赤道掃描），液相用 ATTO 488-DPE（綠色）標(biāo)記，液相用 ATTO 647N-DOPE（紅色）標(biāo)記。

圖 3：甲醇固定 MDA-MB-468 細(xì)胞，用小鼠 IgG 抗 beta-微管蛋白（一級）和用 ATTO 488 標(biāo)記的驢 IgG-fab2-片段抗小鼠（二級）微管蛋白抗體染色。

DNA/RNA（核酸）染色

有時，科學(xué)家可能需要研究細(xì)胞中的核酸，例如，借助熒光顯微鏡，通過檢測細(xì)胞核來計(jì)數(shù)特定類型的細(xì)胞或確定它們的確切位置。最常見的DNA染色劑之一是DAPI （4',6-二氨基-2-苯基吲哚），主要與DNA雙螺旋富含A-T的區(qū)域結(jié)合。與未結(jié)合態(tài)相比，DAPI在DNA上的熒光強(qiáng)度增加。它被紫外線激發(fā)，大波長為 358 納米。發(fā)射光譜寬，峰值為461納米。弱熒光也可以檢測到RNA結(jié)合。在這種情況下，發(fā)射轉(zhuǎn)移到500納米。有趣的是，DAPI能夠滲透完整的細(xì)胞膜。因此，該染料既可用于固定細(xì)胞也可用于活細(xì)胞。

其他常用的 DNA 染色劑有 Hoechst 染色。Hoechst 33258、Hoechst 33342 和 Hoechst 34580 都是雙苯并咪唑類化合物，具有夾雜 DNA 中富含腺嘌呤-胸腺嘧啶（A-T）區(qū)域的傾向。與 DAPI 類似，這些染料被紫外光激發(fā)，與 DNA 結(jié)合時在 455 納米處有發(fā)射值（未結(jié)合時為 510 至 540 納米）。Hoechst 染色劑具有細(xì)胞滲透性，因此可用于固定細(xì)胞和活細(xì)胞。此外，它們的毒性也低于 DAPI。

碘化丙啶是一種膜滲透性 DNA 染色劑，通常用于區(qū)分細(xì)胞培養(yǎng)中的活細(xì)胞和死細(xì)胞，因?yàn)樗鼰o法進(jìn)入完整的細(xì)胞。碘化丙啶也是一種插層劑，但對不同的堿沒有結(jié)合偏好。在與核酸結(jié)合的狀態(tài)下，它的激發(fā)波長為 538 納米，發(fā)射波長為 617 納米。未結(jié)合的碘化丙啶激發(fā)和發(fā)射大值向低波長和低強(qiáng)度移動。它也可以在不改變其熒光特性的情況下與RNA結(jié)合。要區(qū)分 DNA 和 RNA，必須使用適當(dāng)?shù)暮怂崦浮?/p>

吖啶橙是一種無需任何修飾就能區(qū)分 DNA 和 RNA 的染料。與 DNA 結(jié)合時，其激發(fā)/發(fā)射波長為 502 nm/525 nm；與 RNA 結(jié)合時，其激發(fā)/發(fā)射對波長為 460 nm/650 nm。此外，該染料還可以進(jìn)入酸性間室中，如溶酶體。陽離子染料在酸性間室中質(zhì)子化。在這種酸性環(huán)境中，吖啶橙受藍(lán)色光譜中的光激發(fā)，而橙色區(qū)域的發(fā)射較強(qiáng)。該染料通常用于識別凋亡細(xì)胞，因?yàn)榈蛲黾?xì)胞有很多被吞噬的酸性間室。

間室與細(xì)胞器特異性染料

有許多特定的染料可用于研究細(xì)胞區(qū)室，如溶酶體、內(nèi)體或液泡（存在于酵母中，如 S. cerevisiae）以及細(xì)胞器，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (ER)、高爾基體和細(xì)胞核。圖 4 和圖 5 舉例說明。

細(xì)胞區(qū)室和細(xì)胞器可使用 ATTO-TEC 公司的抗體標(biāo)記試劑盒進(jìn)行染色 [3]?？茖W(xué)家可以利用多克隆和單克隆 IgG 抗體或其他蛋白質(zhì)（如 ATTO 488 和 ATTO 643 結(jié)合物）對標(biāo)本進(jìn)行有效標(biāo)記。

在研究蛋白質(zhì)分泌時，通常會對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行染色。DiOC6(3) [3,3′-二己基氧雜羰花青碘化物]是染色該細(xì)胞器的一種經(jīng)典染料，它是一種綠色熒光親脂性染料，可滲透細(xì)胞并偏愛 ER 膜[4]。不過，它仍能與線粒體等其他細(xì)胞器的膜結(jié)合 [4]。

還可以借助于對細(xì)胞中不同位置有偏好的蛋白質(zhì)來染色感興趣區(qū)域。這種方法的一個例子是小麥胚芽凝集素(WGA)的使用，它與存在于質(zhì)膜中的唾液酸和N-乙酰氨基葡萄糖基特異結(jié)合。

圖 4：小鼠小腦皮層三重標(biāo)記矢狀切片中的浦肯野細(xì)胞或神經(jīng)元。圖像中，紅色表示鈣賓蛋白-D28k 鈣結(jié)合蛋白（抗鈣賓蛋白-D28k/Cy3），綠色表示神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）[抗 GFAP/Cy5]，藍(lán)色表示細(xì)胞核（Hoechst 33258）。

圖 5：用 DAPI（細(xì)胞核，藍(lán)色）、抗-α-tubulin-ATO 488（微管，綠色）和抗-TOMM20-ATO 643（線粒體，紅色）染色的 U2OS 人 骨肉瘤 細(xì)胞。圖像采用共聚焦顯微鏡拍攝。

間室與細(xì)胞器特異性染料

許多重要的細(xì)胞過程，包括細(xì)胞器和囊泡運(yùn)動、細(xì)胞運(yùn)動、細(xì)胞分裂、細(xì)胞分裂、細(xì)胞信號傳導(dǎo)和維持細(xì)胞形狀，都涉及肌動蛋白。肌動蛋白是一組球狀多功能蛋白質(zhì)，構(gòu)成細(xì)胞骨架中的微絲。可用于所有 ATTO 染料的類膠體素共軛物可為肌動蛋白絲的染色和可視化提供強(qiáng)有力的工具[3]。

磷脂在細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮著重要作用。磷脂具有兩親性，能夠形成脂質(zhì)雙分子層，因此是構(gòu)成生物膜（如血漿膜和細(xì)胞內(nèi)膜）的主要成分。磷脂等標(biāo)記膜探針是研究細(xì)胞的有用工具。

結(jié)構(gòu)、脂質(zhì)代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、跨膜擴(kuò)散等。ATTO-TEC 公司提供多種磷脂，這些磷脂以甘油為基礎(chǔ)，帶有一個或兩個脂肪酸（親油基團(tuán)）和一個磷酸鹽單酯殘基（親水基團(tuán)），磷酸鹽單酯殘基可進(jìn)行熒光標(biāo)記[3]。例如，1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DPPE）、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DMPE）、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DOPE）、1-palmitoyl-2-hydroxy-snglycero-3-phosphoethanolamine (PPE)、1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DLPE)。

離子成像

就神經(jīng)元研究、基因活動或細(xì)胞運(yùn)動而言，研究細(xì)胞中的離子濃度是很有意義的。鈉、鈣、氯或鎂離子對許多不同的細(xì)胞活動有著深刻的影響。通常，借助熒光標(biāo)記的螯合劑可以捕獲離子，當(dāng)這些螯合劑與適當(dāng)?shù)碾x子結(jié)合時，就會改變自身的光譜特性。標(biāo)記螯合劑的例子有鈣指示劑 fura-2、indo-1、fluo-3、fluo-4 和鈣綠。對于鈉的檢測，通常使用SBFI（鈉結(jié)合苯并呋喃間苯二甲酸鈉）或鈉綠。此外，PBFI（鉀結(jié)合型苯并呋喃間苯二甲酸酯）還能檢測鉀離子。

功能實(shí)驗(yàn)

“功能實(shí)驗(yàn)"是一個統(tǒng)稱，指的是評估各種功能的標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)，這些功能可以用熒光標(biāo)志物進(jìn)行可視化觀察。這些標(biāo)記物可以包括但不限于上述任何標(biāo)記技術(shù)和熒光團(tuán)。ATTO-TEC 可為許多功能檢測提供染色試劑盒，可輕松應(yīng)用于各種標(biāo)本。這些試劑盒利用多克隆和單克隆 IgG 抗體或其他帶有 ATTO 染料的蛋白質(zhì) [3]。功能檢測的一個例子就是被廣泛使用的活體/死體檢測。兩個熒光團(tuán)分別用于標(biāo)記活細(xì)胞和死細(xì)胞。在同時掌握這兩個值的情況下，就可以評估細(xì)胞的總體健康狀況。將這些信息與其他標(biāo)記聯(lián)系起來，甚至可以加深對任何潛在過程的了解。

熒光染料的激發(fā)峰和發(fā)射峰是什么？

使用熒光染料時，必須注意其激發(fā)和發(fā)射波長峰、溶解性、量子產(chǎn)率、亮度和光穩(wěn)定性。根據(jù)具體應(yīng)用，應(yīng)使用適當(dāng)?shù)娜玖?。熒光染料及其各自的激發(fā)和發(fā)射波長峰的完整列表見下表（PDF 文件）。關(guān)于熒光的基本原理[5]，如與熒光染料激發(fā)光和發(fā)射光之間的波長差有關(guān)的斯托克斯偏移，讀者可參閱參考文獻(xiàn) 4。請注意，峰值是每種染料獨(dú)特的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的一部分。在一次實(shí)驗(yàn)中選擇幾種染料同時使用時（如用于多路復(fù)用和空間生物學(xué)應(yīng)用），研究人員應(yīng)注意由于串?dāng)_或滲漏造成的激發(fā)和發(fā)射光譜重疊，這可能導(dǎo)致假陰性或假陽性，或以其他方式使數(shù)據(jù)模糊不清。細(xì)胞和組織中的天然熒光蛋白或生物大分子產(chǎn)生的自發(fā)熒光也會使熒光成像失真。在進(jìn)行植物或藻類實(shí)驗(yàn)時，尤其需要考慮到這一點(diǎn)。不過，如果使用激發(fā)波長長于 550 nm 的染料，可以減少自發(fā)熒光造成的干擾。充分了解染料光譜也很重要，這樣才能對激發(fā)光源（如 LED、弧光燈或激光線）以及發(fā)射濾光器和探測器做出選擇。ATTO 染料光譜[3]示例見下圖 6。有關(guān) ATTO 染料的激發(fā)和發(fā)射波長峰、溶解度、量子產(chǎn)率、亮度和光穩(wěn)定性的信息和數(shù)據(jù)，請參閱參考文獻(xiàn) 2。

圖 6：ATTO 488（綠色曲線）和 ATTO 553H（黃色曲線）的熒光發(fā)射曲線?？梢郧宄乜吹絻蓚€發(fā)射光譜的重疊。紅線表示 488 發(fā)射濾波器的波段。

參考文獻(xiàn)：

1、C.Greb, J. DeRose, Introduction to Fluorescent Proteins：光譜和光度特性概述， Leica Microsystems 科學(xué)實(shí)驗(yàn)室 (2023)。

2、K.Horisawa, 利用點(diǎn)擊化學(xué)對生物分子進(jìn)行特異性和定量標(biāo)記，F(xiàn)ront.Physiol.2014 秒系統(tǒng)生物學(xué)檔案，第 5 卷第 5 條。20160677. 請勿：10.3389/fphys.2014.00457.

3、目錄，熒光標(biāo)簽和染料，ATTO-TEC (2024/2025) Leica Microsystems。

4、A.J. Koning、P.Y. Lum、J.M. Williams、R. Wright，DiOC6 染色顯示活酵母細(xì)胞的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和動力學(xué)，《細(xì)胞運(yùn)動和細(xì)胞骨架》（1993 年），第 25 卷，第 2 期。2, pp：10.1002/cm.970250202.

5、W.Ockenga, J. DeRose, An Introduction to Fluorescence：光致發(fā)光現(xiàn)象背后的基本理論--熒光和磷光，科學(xué)實(shí)驗(yàn)室（2023 年）徠卡微系統(tǒng)。

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