2021年10月27日，來(lái)自全國(guó)各地的Leica STED用戶齊聚上海，參加了2021年徠卡STED club顯微成像技術(shù)交流會(huì)。

開(kāi)幕式上，徠卡顯微系統(tǒng)中國(guó)區(qū)總經(jīng)理陳淮先生對(duì)各位專家的蒞臨表示了歡迎，回顧了Leica在超高分辨成像領(lǐng)域多年的耕耘，并表示Leica會(huì)堅(jiān)持和客戶共同成長(zhǎng)，為客戶們提供更好的產(chǎn)品和服務(wù)。

會(huì)上諸多Leica的資深用戶分享了自己的研究成果與心得體會(huì)，我們一起來(lái)回顧下吧。
講題一：超分辨成像技術(shù)研究進(jìn)展
講者：深圳大學(xué) 屈軍樂(lè) 教授

本次徠卡STED用戶會(huì)學(xué)術(shù)交流環(huán)節(jié)的開(kāi)場(chǎng)報(bào)告由深圳大學(xué)物理與光電工程學(xué)院的屈軍樂(lè)教授帶來(lái)，報(bào)告題目為“超分辨成像技術(shù)研究進(jìn)展"。屈教授長(zhǎng)期從事超分辨熒光顯微技術(shù)及其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究并在該領(lǐng)域造詣?lì)H深。本次報(bào)告中，屈教授不僅向我們介紹了他所帶領(lǐng)的研究團(tuán)隊(duì)一路走來(lái)所發(fā)展的STED技術(shù)（包括自適應(yīng)光學(xué)STED、相圖分析STED、數(shù)字增強(qiáng)STED、時(shí)空調(diào)制STED、頻率調(diào)制STED等）及其應(yīng)用，還和我們分享了他們團(tuán)隊(duì)熒光染料開(kāi)發(fā)的成果及寶貴經(jīng)驗(yàn)。將STED的成像技術(shù)提升和新型熒光染料“雙劍合璧"后，屈教授的團(tuán)隊(duì)實(shí)現(xiàn)了STED空間分辨率提升、長(zhǎng)時(shí)間活細(xì)胞成像、低損耗光功率成像等多項(xiàng)技術(shù)突破。屈教授坦言，他在99年剛到深圳大學(xué)時(shí)就接觸到徠卡SP2共聚焦，至今使用過(guò)多款徠卡顯微成像設(shè)備，并對(duì)徠卡顯微鏡的成像質(zhì)量和硬件品質(zhì)給予了很高的評(píng)價(jià)。
講題二：受激輻射顯微鏡在多種生物樣品中的應(yīng)用
講者：上?？萍即髮W(xué) 李曉明 主任

李曉明老師作為上海科技大學(xué)生命學(xué)院分子影像平臺(tái)主任，自2016年平臺(tái)成立以來(lái)，針對(duì)實(shí)驗(yàn)室不同研究需求采購(gòu)了多個(gè)廠家的超高分辨率顯微鏡，其中就包括徠卡STED納米顯微成像設(shè)備。此次會(huì)議中李老師針對(duì)STED成像優(yōu)勢(shì)、成像過(guò)程中遇到的問(wèn)題、解決方法及實(shí)際應(yīng)用展開(kāi)了詳細(xì)介紹。
李老師首先就幾臺(tái)超高顯微鏡的特點(diǎn)，包括分辨率、靈敏度、特殊制樣、所見(jiàn)即所得等多方面進(jìn)行對(duì)比。STED納米顯微鏡在分辨率方面可突破50nm，并做到所見(jiàn)即所得，但由于STED技術(shù)特點(diǎn)，獲得高分辨率的同時(shí)會(huì)受到一些限制，比如需要特殊制樣，樣品不易太厚，成像深度不夠，樣品本身需要一定的熒光亮度和信噪比，并且由于較強(qiáng)的STED損耗光無(wú)法進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間活細(xì)胞成像等。隨后李老師針對(duì)這些問(wèn)題給出了一些解決或優(yōu)化方法，在樣品制備時(shí)，李老師推薦參考徠卡STED樣品制備手冊(cè)The_Guide_to_STED_Sample_Preparation_MC-0002370_25032021.pdf ，其中會(huì)標(biāo)注注意事項(xiàng)及推薦的染料信息，值得一看。總結(jié)幾點(diǎn)：優(yōu)先選擇775脈沖激光器；選擇受激輻射效果好、信號(hào)亮、熒光穩(wěn)定的染料；選擇合適封片劑和標(biāo)準(zhǔn)蓋玻片可減少折射率的影響，提高成像深度。在拍攝多通道時(shí)，注意拍攝順序，當(dāng)不同通道出現(xiàn)位置色差時(shí)可用STED標(biāo)尺校正。超高顯微鏡的共定位分析不再簡(jiǎn)單的看兩個(gè)通道是否重合，而是通過(guò)測(cè)兩個(gè)蛋白間的距離來(lái)判斷相關(guān)性。并且結(jié)合熒光壽命的新一代TauSTED的出現(xiàn)使得對(duì)厚樣品不同層、活細(xì)胞不同時(shí)間的連續(xù)成像成為了可能。

講題三：FLIM-FRET及STED技術(shù)聯(lián)合使用在呼吸道病毒科研中的應(yīng)用
講者：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所 陳燕麗 助理研究員
陳老師在講座中介紹到共聚焦顯微鏡在呼吸道病毒的研究中應(yīng)用領(lǐng)域很多，包括病毒與宿主蛋白的相互作用，例如病毒感染細(xì)胞會(huì)發(fā)生線粒體應(yīng)激，產(chǎn)生線粒體DNA釋放，N蛋白與其他蛋白的離體和在體相互關(guān)系等。
陳老師所在課題組制備了EVD68病毒的單克隆抗體A6-1,,為了研究抗體和病毒顆粒的相互作用，利用了FLIM-FRET技術(shù)，測(cè)定了兩個(gè)毒株（KM毒株，F(xiàn)ermon毒株）的六個(gè)病毒片段和抗體的相互作用。發(fā)現(xiàn)VP1-1與A6-1的相互作用FRET高，并且使用其他的研究手段確定了二者的結(jié)合位點(diǎn)。
還研究了流感病毒的單克隆抗體CR9114，這個(gè)抗體和高危的流感毒株H1N1及H7N9的親和力不高。通過(guò)改造抗體的輕鏈和重鏈，并且測(cè)定了和H1N1及H7N9的FRET效率，證實(shí)通過(guò)改造提高了CR9114和H1N1和H7N9的結(jié)合效率。還使用STED超高分辨顯微鏡觀察了納米顆粒疫苗的超微結(jié)構(gòu)。

最后，陳老師總結(jié)道，F(xiàn)LIM-FRET可以用于呼吸道病毒顆粒和其抗體之間結(jié)合力的篩選，也可以用于改造后的抗體親和力鑒定，在呼吸道病毒研究方面有廣泛的應(yīng)用前景。
講題四：Super-resolution microscopy in biomedical research: challenges and potentials
講者：Christian Eggeling, Friedrich Schiller University Jena  

來(lái)自于德國(guó)耶拿大學(xué)的Eggeling教授在此次講座中主要介紹了他們實(shí)驗(yàn)室在生物膜分子運(yùn)動(dòng)研究中STED-FCS的應(yīng)用。分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)一般可用于分子結(jié)合力的研究，例如，熒光標(biāo)記的小分子在和大分子結(jié)合后，由于質(zhì)量變大，運(yùn)動(dòng)速率降低；另一個(gè)重要的應(yīng)用在于在納米尺度上研究細(xì)胞膜上的生物活性。而研究分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)的經(jīng)典方法之一就是熒光相關(guān)光譜（Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS）。FCS通過(guò)測(cè)定溶液中微區(qū)內(nèi)發(fā)光粒子因布朗運(yùn)動(dòng)或化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生的熒光漲落現(xiàn)象，分析熒光漲落的相關(guān)函數(shù)而獲得單個(gè)粒子的濃度、化學(xué)動(dòng)力學(xué)等參數(shù)信息。細(xì)胞膜上的脂筏富含膽固醇和鞘磷脂，是一個(gè)高度異質(zhì)化和活躍的微小區(qū)域（<200nm），正是由于這一特點(diǎn)，使得其上的分子運(yùn)動(dòng)很難被觀察到。為了研究這一問(wèn)題，Eggeling教授團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了兩個(gè)熒光標(biāo)記（Atto647N）的脂類分子，甘油磷脂（PE）和鞘磷脂(SM)，利用FCS來(lái)觀察這兩個(gè)分子在質(zhì)膜上的運(yùn)動(dòng)方式。PE和SM在膜上聚集、運(yùn)動(dòng)方式不同，SM更加密集，以一個(gè)整體來(lái)運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)速率應(yīng)該較慢；而PE則是以散落的形式，更自由、快速的運(yùn)動(dòng)。使用Confocal-FCS來(lái)觀察這兩者的運(yùn)動(dòng)差別，由于空間分辨率的不足，無(wú)法得出有效FCS數(shù)據(jù)來(lái)支持以上假設(shè)。Eggeling教授進(jìn)而使用了可以提供更高空間分辨率的STED-FCS來(lái)進(jìn)行觀察。分析結(jié)果表明PE在膜上是自由擴(kuò)散，而SM會(huì)時(shí)不時(shí)被有膽固醇參與的“陷阱"捕獲而停止運(yùn)動(dòng)。線掃STED-FCS結(jié)果表明，SM被捕獲（trapping）的時(shí)間大概持續(xù)幾秒，且這種現(xiàn)象只有在空間分辨率高于80nm時(shí)才可觀察到。STED-FCS研究分子運(yùn)動(dòng)的方法可用于研究在免疫反應(yīng)中T細(xì)胞的激活過(guò)程里脂類分子的運(yùn)動(dòng)機(jī)制和HIV病毒侵染宿主細(xì)胞后的Budding過(guò)程中的所涉及的脂類分子。
報(bào)告結(jié)束后，各位參會(huì)代表還前往丹納赫中國(guó)總部參觀了生命科學(xué)平臺(tái)的客戶體驗(yàn)中心，了解了丹納赫在生命科學(xué)領(lǐng)域的多種解決方案。

整場(chǎng)活動(dòng)內(nèi)容精彩紛呈，通過(guò)親身感受，各位專家表現(xiàn)出對(duì)徠卡超高分辨率解決方案濃厚的興趣。同時(shí)，對(duì)于由于疫情原因未能親臨現(xiàn)場(chǎng)的老師，本次活動(dòng)也提供現(xiàn)場(chǎng)直播的環(huán)節(jié)?，F(xiàn)在，直播內(nèi)容已經(jīng)整理完畢，除了部分未發(fā)表數(shù)據(jù)應(yīng)講者要求隱藏之外，其他內(nèi)容均已可以在線回看。

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